淺析COIP的正確操作步驟!小編來帶你了解一下!
一、細胞的甲醛交聯與超聲破碎(第一天)
1.取出1平皿細胞(10cm平皿),加入243ul37%甲醛,使得甲醛的終濃度為1%(培養基共有9ml)。
2.37℃孵育10min。
3.終止交聯:加甘氨酸至終濃度為0.125M。450ul2.5M甘氨酸于平皿中。混勻后,在室溫下放置5min即可。
4.吸盡培養基,用冰冷的PBS清洗細胞2次。
5.細胞刮刀收集細胞于15ml離心管中(PBS依次為5ml,3ml和3ml)。預冷后2000rpm5min收集細胞。
6.倒去上清。按照細胞量,加入SDSLysisBuffer。使得細胞終濃度為每200ul含2x106個細胞。這樣每100ul溶液含1x106個細胞。再加入蛋白酶抑制劑復合物。假設MCF7長滿板為5x106個細胞。本次細胞長得約為80%。即為4x106個細胞。因此每管加入400ulSDSLysisBuffer。將2管混在一起,共800ul。
7.超聲破碎:VCX750,25%功率,4.5s沖擊,9s間隙。共14次。
二、除雜及抗體哺育(第一天)
1.超聲破碎結束后,10000g4℃離心10min。去除不溶物質。
2.留取300ul做實驗,其余保存于-80℃。
3.300ul中,100ul加抗體做為實驗組;100ul不加抗體做為對照組;100ul加入4ul5MNaCl(NaCl終濃度為0.2M),65℃處理3h解交聯,跑電泳,檢測超聲破碎的效果。
4.在100ul的超聲破碎產物中,加入900ulChIPDilutionBuffer和20ul的50xPIC。
再各加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉混勻1h。
5.1h后,在4℃靜置10min沉淀,700rpm離心1min。
6.取上清。各留取20ul做為input。一管中加入1ul抗體,另一管中則不加抗體。4℃顛轉過夜。
三、檢驗超聲破碎的效果(第一天)
1.取100ul超聲破碎后產物,加入4ul5MNaCl,65℃處理2h解交聯。
2.分出一半用酚/氯仿抽提。電泳檢測超聲效果。
四、COIP免疫復合物的沉淀及清洗(第二天)
1.孵育過夜后,每管中加入60ulProteinAAgarose/SalmonSpermDNA。4℃顛轉2h。
2.4℃靜置10min后,700rpm離心1min。除去上清。
3.依次用下列溶液清洗沉淀復合物。清洗的步驟:加入溶液,在4℃顛轉10min,4℃靜置10min沉淀,700rpm離心1min,除去上清。
洗滌溶液:
(1)lowsaltwashbuffer-onewash
?。?)highsaltwashbuffer-onewash
(3)LiClwashbuffer-onewash
?。?)TEbuffer-twowash
4.清洗完畢后,開始洗脫。
洗脫液的配方:100ul10%SDS,100ul1MNaHCO3,800ulddH2O,共1ml。
每管加入250ul洗脫buffer,室溫下顛轉15min,靜置離心后,收集上清。重復洗滌一次。最終的洗脫液為每管500ul。
5.解交聯:每管中加入20ul5MNaCl(NaCl終濃度為0.2M)。
6.混勻,65℃解交聯過夜。
五、DNA樣品的回收(第三天)
1.解交聯結束后,每管加入1ulRNaseA(MBI),37℃孵育1h。
2.每管加入10ul0.5MEDTA,20ul1MTris.HCl(PH6.5),2ul10mg/ml蛋白酶K。45℃處理2h。
3.DNA片段的回收----omega膠回收試劑盒。最終的樣品溶于100ulddH2O。