1. 頸椎脫臼法處死SD大鼠。
2. 剃去背毛,75%酒精浸泡5min。
3. 從尾椎處剪開皮膚,取出腰椎。
4. 盡量剔除附著的肌肉,用含2%雙抗的PBS沖洗3-5次。
5. 分離椎節,切開纖維環分離凝膠狀髓核,將凝膠狀髓核置于PBS中沖洗 3 次,去除血跡,剪碎髓核組織呈 1mm3大小,移至離心管后加入5倍體積的1.5%Ⅱ型膠原酶,37℃搖床消化2h。
6. 消化結束 ,20%FBS終止消化,100um濾網過濾,1000r/min 離心 5min,棄上清后DMEM/F12 重懸,按 1×105 /ml接種于培養板,加入含1%雙抗和 15% FBS 的 DMEM/F12,置于 37 ℃細胞培養箱中培養。
7. 4 d后首次換液,以后每3天換換液 1 次,細胞達 90% 融合后傳代