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胚胎大鼠腦神經(jīng)干細(xì)胞的分離和培養(yǎng)
1. 犧牲胎齡14-16天的SD大鼠,刮除腹部手術(shù)區(qū)域的毛發(fā),75%乙醇全身浸泡消毒。
2. 解剖孕鼠,取出子宮并沖洗。
3. 取出胚胎,置于含有冰冷的HBSS液平皿中。
4. 手術(shù)顯微鏡下剝離出大腦半球,小心地剝?nèi)ツX膜和血管。
5. 剝?nèi)ツX膜和血管的大腦皮質(zhì),用冰冷的HBSS液清洗三次。
6. 將大腦皮質(zhì)剪成1mm3的小塊,用1ml槍頭輕輕吹打后,使之成為細(xì)胞懸液,并通過70um的篩網(wǎng)過濾。
7. 將收集到的細(xì)胞懸液離心后,用神經(jīng)干細(xì)胞基礎(chǔ)培養(yǎng)液重懸,然后離心,棄掉上清液。
8. 經(jīng)計(jì)數(shù)和活力觀察,將細(xì)胞密度調(diào)至1×106/ml,以1.5×105/ml的細(xì)胞密度種入T25培養(yǎng)瓶中,同時(shí)加入FGF-2和EGF于5%CO2、37℃環(huán)境中培養(yǎng),直到神經(jīng)干細(xì)胞分裂、增殖形成較大的神經(jīng)細(xì)胞球后再作傳代處理。
9. 細(xì)胞傳代,將神經(jīng)細(xì)胞球懸液移至離心管,經(jīng)低速離心后,吸棄上清液,加入神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液,用200ul槍頭吹打,使之成為單個(gè)細(xì)胞懸液,定量加入神經(jīng)干細(xì)胞完全培養(yǎng)液后,進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)和活力觀察。
10. 傳代后的細(xì)胞既可用來誘導(dǎo)分化,也可以繼續(xù)種瓶培養(yǎng),還可以冷凍保存以備后用。
11. 神經(jīng)干細(xì)胞的分化和鑒定。
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