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簡(jiǎn)要描述:DNA片段的克隆需要合適的載體,載體或是質(zhì)粒,或是噬菌體,或是病毒,通常大多經(jīng)過人工改造。作為載體必須具備兩條件:一是該載體在細(xì)胞內(nèi)必須能自主復(fù)制,即必須具備復(fù)制原點(diǎn);二是該載體必須具備適合的酶切位點(diǎn),且這些酶切位點(diǎn)不在復(fù)制原點(diǎn)區(qū)域內(nèi)。以上兩條,保證了載體的可繁殖性和可利用性。為了便于獲得陽隆克隆,載體上常有篩選標(biāo)記,如對(duì)抗菌素的抗性,某些基因產(chǎn)物的顯色反應(yīng)等。
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一、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)Molecular cloning 服務(wù)介紹
分子克隆是在分子水平上提供一種純化和擴(kuò)增特定DNA片段的方法。常含有目的基因,用體外重組方法將它們插入克隆載體,形成重組克隆載體,通過轉(zhuǎn)化與轉(zhuǎn)導(dǎo)的方式,引入適合的寄主體內(nèi)得到復(fù)制與擴(kuò)增,然后再從篩選的寄主細(xì)胞內(nèi)分離提純所需的克隆載體,可以得到插入DNA的許多拷貝,從而獲得目的基因的擴(kuò)增。
二、分子克隆與質(zhì)粒載體構(gòu)建實(shí)驗(yàn)Molecular cloning 實(shí)驗(yàn)原理
外源DNA與載體分子的連接就是DNA重組,這樣重新組合的DNA叫做重組體或重組子。重組的DNA分子是在DNA連接酶的作用下,有Mg2%2B、ATP存在的連接緩沖系統(tǒng)中,將分別經(jīng)酶切的載體分子與外源DNA分子進(jìn)行連接。DNA連接酶有兩種:T4噬菌體DNA連接酶和大腸桿菌DNA連接酶。兩種DNA連接酶都有將兩個(gè)帶有相同粘性末端的DNA分子連在一起的功能,而且T4噬菌體DNA連接酶還有—種大腸桿菌連接酶沒有的特性,即能使兩個(gè)平末端的雙鏈DNA分子連接起來。但這種連接的效率比粘性末端的連接效率低,一般可通過提高T4噬菌體DNA連接酶濃度或增加DNA濃度來提高平末端的連接效率。
T4噬菌體DNA連接酶催化DNA連接反應(yīng)分為3步:先,T4DNA連接酶與輔助因子ATP形成酶—AMP復(fù)合物;然后,酶—AMP復(fù)合物再結(jié)合到具有5’磷酸基和3’羥基切口的DNA上,使DNA腺苷化;后產(chǎn)生一個(gè)新的磷酸二酯鍵,把切口封起來。
DNA重組的方法主要有粘端連接法和平端連接法,為了防止載體本身的自連,可以通過(牛小腸堿性磷酸酶)CIP處理克服。
連接反應(yīng)的溫度在37℃時(shí)有利于連接酶的活性.但是在這個(gè)溫度下,粘性末端的氫鍵結(jié)合是不穩(wěn)定的。因此人們找到了一個(gè)折中溫度,即12-16℃,連接12-16h(過夜),這樣既可大限度地發(fā)揮連接酶的活性,又兼顧到短暫配對(duì)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定。
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