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樣品準備
組織樣品:
將組織剪成細小的碎片,按每20mg組織加入150-250μl裂解液的比例加入裂解液(裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑),勻漿器勻漿直至完全裂解。裂解后的樣品4℃ 12000g 離心15分鐘,取上清,進行蛋白質定量后貯存于-80℃冰箱。
1.蛋白定量;
2. 根據樣品數量,將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液,充分混勻;
3. 各孔加入160μl BCA工作液;
4. 把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec,37℃放置30分鐘,然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標,蛋白濃度(μg/μl)為縱坐標,繪出標準曲線;
5. 在酶標板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS(稀釋10倍),加入160μl BCA工作液,把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec,37℃放置30分鐘,然后在562nm下測定吸光度。
6. 根據所測樣品的吸光值,在標準曲線上即可查得相應的蛋白濃度(μg/μl),乘以樣品稀釋倍數(10)即為樣品實際濃度(單位:μg /μl)。
PAGE膠的制備
1. 下層分離膠的制備
根據目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度,高分子量蛋白用低濃度膠,低分子量蛋白用高濃度膠分離。 P62 60kDa LC3B 14,16kDa GAPDH 37kDa 故選用 10% 和15% 的膠。 不同濃度的分離膠按下表進行配制,待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。
2. 上層濃縮膠的配制
根據需要按下表配制濃縮膠,并插好梳子。
上樣及電泳
1. 上樣
每孔上樣量約為 15 μl蛋白,可以根據實驗要求加大上樣量。根據蛋白定量結果取所需蛋白加入適量上樣緩沖液,沸水浴10min后離心取上清上樣。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中,加入適量電泳緩沖液,取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔,避免孔內有余膠殘留影響上樣。將準備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應的孔內,注意勿溢出加樣孔。
2. 電泳
一般濃縮膠80V 20分鐘,分離膠120V 60分鐘,可以根據具體實驗要求調整電壓和時間。當染料到達膠底部時切斷電源,停止電泳,進行下一步轉膜。
轉膜
轉膜分為濕轉和半干轉,本實驗室選用半干轉。
半干式轉膜中,三明治的排列為:/慮紙/膠/膜/慮紙,用電轉緩沖液浸濕后,直接置于電轉儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。半干式的電轉緩沖液不同于濕式的電轉緩沖液,推薦為:48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉膜30分鐘即可。轉膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘(NC膜在電轉液中浸泡10-20分鐘),再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5 分鐘,膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡3-5 分鐘,否則轉膜時會導致條帶變形。
膜上蛋白的檢測
為檢測轉膜是否成功,可用麗春紅染色,麗春紅染色工作液:2%的麗春紅貯備液1:10 稀釋,即加9 倍的ddH2O
染色方法:將膜放入TBST 洗一次,再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下搖動染色5 分鐘,大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰,(膜也可以用TBST 或水重新洗后再進行染色)PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。
膜的封閉及抗體孵育
1. 封閉:5%脫脂奶粉(檢測磷酸化蛋白用BSA)室溫封閉1小時或4℃過夜。
2. 一抗:根據說明書 P62 1:1000 LC3B 1:1000 GAPDH 1:2000 稀釋抗體,抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度,和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜。
3. 二抗:孵育一抗的膜用TBST洗滌3次,每次5min。隨后根據用量,按照1:1000稀釋HRP標記的二抗,與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌3次,每次5min。
顯色
ECL化學發光檢測:配制ECL發光液,根據用量,取ECL發光液A和B等量混勻,加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液,用紙小心吸取顯色液,在上面蓋上一層平整的透明紙。將其放入成像系統中進行掃描??梢愿鶕l帶強弱再次感光或減短感光時間已達到理想結果。
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